用熒光原位雜交技術(shù)解碼基因圖譜
隨著原位雜交技術(shù)的引入,細(xì)胞遺傳學(xué)進(jìn)入了分子時(shí)代,原位雜交技術(shù)使研究人員能夠定位染色體上特定DNA序列的位置。自 1969 年首次原位雜交實(shí)驗(yàn)以來,該過程的許多變體已經(jīng)被開發(fā)出來,其靈敏度也大大提高。如今,大多數(shù)原位雜交程序使用熒光探針來檢測(cè) DNA 序列,該過程通常稱為熒光原位雜交(fluorescent in situ hybridization,F(xiàn)ISH)。細(xì)胞遺傳學(xué)家可以使用多種 FISH 程序來診斷患者多種類型的染色體異常。FISH 以及所有其他原位雜交方法的成功取決于DNA雙螺旋的穩(wěn)定性。
熒光原位雜交
熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescence in situ hybridization,F(xiàn)ISH)是一種分子遺傳學(xué)技術(shù),原理是采用熒光染料標(biāo)記的DNA 探針與組織細(xì)胞中待測(cè)的核酸按堿基配對(duì)原則進(jìn)行特異性結(jié)合,通過熒光顯微鏡檢測(cè)信號(hào)得出結(jié)果,從而檢測(cè)細(xì)胞和組織樣本中的染色體和基因異常。FISH 技術(shù)幾乎可以快速檢測(cè)任何類型組織細(xì)胞的染色體異常,不管組織是新鮮的或是一些甲醛溶液(福爾馬林)固定的陳舊組織標(biāo)本。
FISH被廣泛接受用于乳腺癌、肺癌、膀胱癌、宮頸癌、淋巴瘤等實(shí)體瘤的輔助診斷,其目的主要集中在對(duì)腫瘤的早期診斷、療效檢測(cè)、個(gè)體化治療和預(yù)后判斷等幾個(gè)方面。FISH 作為一項(xiàng)很重要的分子遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù),在血液腫瘤的診斷中也有很大的作用,得到了NCCN 等國內(nèi)外各大血液腫瘤診療指南的認(rèn)可和建議。目前與血液腫瘤相關(guān)的FISH 探針有接近100 種,常用的就有60 種左右,包括急慢性白血病、骨髓增生異常綜合癥(MDS)、多發(fā)性骨髓瘤(MM)、淋巴瘤等多種血液腫瘤。
熒光原位雜交的原理
在分子雜交中,標(biāo)記的 DNA 或RNA序列用作探針來識(shí)別或定量生物樣品中序列的天然對(duì)應(yīng)物。20 世紀(jì) 60 年代,研究人員 Joseph Gall 和 Mary Lou Pardue 意識(shí)到分子雜交可用于鑒定 DNA 序列的原位位置(即染色體內(nèi)的自然位置)。
Gall 和 Pardue 的工作完成后不久,熒光標(biāo)記迅速取代了雜交探針中的放射性標(biāo)記,因?yàn)樗鼈兙哂懈叩陌踩?、穩(wěn)定性和易于檢測(cè)性。事實(shí)上,當(dāng)前大多數(shù)原位雜交都是使用 FISH 程序完成的。
熒光原位雜交 (FISH)原理
該過程的第一步是制作探針序列的熒光副本,或探針序列的修改副本,該副本可以在稍后的過程中呈現(xiàn)熒光。接下來,在發(fā)生任何雜交之前,必須用熱或化學(xué)物質(zhì)使靶序列和探針序列變性。這種變性為了在隨后的雜交步驟中在靶標(biāo)和探針之間形成新的氫鍵,該步驟是必要的。然后將探針和靶序列混合在一起,探針與染色體上的互補(bǔ)序列特異性雜交。如果探針已經(jīng)發(fā)出熒光,則可以直接檢測(cè)雜交位點(diǎn)。在其他情況下,可能需要額外的步驟來可視化雜交探針。探針與其染色體靶標(biāo)之間形成的雜交體可以使用熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。
當(dāng)研究人員設(shè)計(jì) FISH 實(shí)驗(yàn)時(shí),他們需要考慮實(shí)驗(yàn)所需的靈敏度和分辨率是否在熒光顯微鏡的技術(shù)限制范圍內(nèi)。靈敏度取決于特定顯微鏡的聚光能力,這決定了是否可以檢測(cè)到比大目標(biāo)序列更難看到的小目標(biāo)序列。分辨率是指沿著染色體長度區(qū)分兩點(diǎn)的能力,光學(xué)顯微鏡無法分辨間隔小于 200-250 nm(可見光譜下限)的物體??紤]到這些技術(shù)限制,研究人員還需要考慮染色體內(nèi) DNA 的構(gòu)象。中期染色體比間期染色體致密數(shù)千倍,而間期染色體又比裸露 DNA 致密至少十倍。當(dāng)所有這些因素一起考慮時(shí),研究人員通常期望獲得中期染色體上位置的巨大堿基范圍和間期染色體數(shù)萬個(gè)堿基內(nèi)的分辨率。
熒光原位雜交的技術(shù)優(yōu)勢(shì)
與其他原位雜交技術(shù)相比,熒光原位雜交的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在:
1. FISH 技術(shù)更敏感,可檢測(cè)出核型分析檢測(cè)不出的細(xì)微缺失或易位,如MDS 中的5q 缺失綜合征;
2. FISH 技術(shù)不需要中期分裂相細(xì)胞,而核型分析需要培養(yǎng)時(shí)間較長且需要較高的操作要求;
3. FISH 技術(shù)是在細(xì)胞形態(tài)的基礎(chǔ)上進(jìn)行結(jié)果判讀,可有效地降低假陰性或假陽性的風(fēng)險(xiǎn),而PCR 技術(shù)經(jīng)過倍增擴(kuò)增,不能在形態(tài)的基礎(chǔ)上判讀,對(duì)實(shí)驗(yàn)要求高,易產(chǎn)生假陰性或假陽性。
4. 多色FISH通過在同一個(gè)核中顯示不同的顏色可同時(shí)檢測(cè)多種序列。
熒光原位雜交的應(yīng)用
1. 使用 FISH 鑒定基因位置
FISH 提供了一種強(qiáng)大的工具來識(shí)別克隆 DNA 序列在中期染色體上的位置。從歷史上看,F(xiàn)ISH 和其他原位雜交結(jié)果在繪制人類染色體上的基因圖譜方面發(fā)揮了主要作用。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果被收集并編譯到數(shù)據(jù)庫中,這些信息在人類基因組計(jì)劃(HGP)的注釋階段被證明是有用的。現(xiàn)在人類基因組測(cè)序已經(jīng)完成,研究人員很少使用原位雜交來簡單地確定人類基因的染色體位置。目前,人類 FISH 應(yīng)用主要針對(duì)臨床診斷。
2. 使用核型和 FISH 診斷染色體異常
FISH 和其他原位 雜交技術(shù)對(duì)于各種染色體異常(包括缺失、重復(fù)和易位)的臨床診斷非常重要。如今,細(xì)胞遺傳學(xué)家能夠利用廣泛的 HGP 克隆資源來精確識(shí)別核型中出現(xiàn)的染色體重排位點(diǎn)。事實(shí)上,一個(gè)科學(xué)家聯(lián)盟已經(jīng)將人類基因組計(jì)劃中的 7000 多個(gè) DNA 克隆映射到人類染色體上的特定條帶上。
3. 使用 FISH 探針集合“繪制”整個(gè)染色體
使用位點(diǎn)特異性探針檢測(cè)染色體重排可能是一項(xiàng)漫長的工作,特別是如果發(fā)生了復(fù)雜的重排或重排區(qū)域難以通過核型中的帶型模式識(shí)別。幸運(yùn)的是,細(xì)胞遺傳學(xué)家現(xiàn)在可以選擇使用多熒光 FISH(或光譜核型分析)來快速掃描一組中期染色體以發(fā)現(xiàn)潛在的重排。多熒光 FISH 生成核型,其中每條染色體似乎都涂有不同的顏色。每個(gè)“油漆”實(shí)際上是跨越特定染色體長度的序列的雜交探針的集合。
盡管染色體涂料可以快速評(píng)估中期擴(kuò)散中的大染色體變化,但該方法的分辨率有限。因此,雖然染色體涂色允許研究人員快速識(shí)別涉及易位的染色體并識(shí)別大的缺失和/或重復(fù),但小缺失和重復(fù)將無法檢測(cè)到。如果研究人員需要有關(guān)染色體重排所涉及的實(shí)際序列的更多詳細(xì)信息,他們需要使用位點(diǎn)特異性探針進(jìn)行后續(xù)研究。
4. 使用 FISH 分析間期染色體
自從引入 FISH 以來,細(xì)胞遺傳學(xué)家已經(jīng)能夠分析間期染色體以及用于核型分析的中期染色體。這提供了真正的實(shí)用優(yōu)勢(shì),因?yàn)樵跍?zhǔn)備染色體進(jìn)行分析之前,細(xì)胞不需要培養(yǎng)數(shù)天或數(shù)周。此外,F(xiàn)ISH 可用于分析實(shí)體瘤等標(biāo)本的染色體,這些標(biāo)本具有很大的臨床意義,但不經(jīng)常分裂。FISH 的另一個(gè)有用功能是,如果雜交探針標(biāo)記有不同的熒光團(tuán),研究人員就能夠同時(shí)監(jiān)測(cè)多個(gè)位點(diǎn)。
間期FISH的另一項(xiàng)研究應(yīng)用是利用染色體特異性顏料來獲取有關(guān)細(xì)胞核內(nèi)染色體組織的信息。通過創(chuàng)造性地將染色體特異性探針與基因特異性探針和抗體結(jié)合起來,研究人員可以使用 FISH 提供有關(guān)核結(jié)構(gòu)的令人興奮的新見解。
熒光原位雜交用什么顯微鏡
FISH樣本觀察主要使用正置研究級(jí)熒光顯微鏡,同時(shí)需要搭配高靈敏度相機(jī)和FISH圖文系統(tǒng)來完成。對(duì)整套方案都有較高的要求,主要體現(xiàn)在以下幾點(diǎn):
1. 根據(jù)FISH染料做過優(yōu)化的高品質(zhì)FISH專用熒光濾色片組提供最佳的圖像對(duì)比度。具有高透過率、高截止深度和高光譜陡度的優(yōu)點(diǎn),保證足夠亮度的同時(shí),提供最佳的圖像對(duì)比度,同時(shí)還要求消除串色的影響和多色圖像疊加零漂移;
2. FISH專用10x、20x、40x、100x復(fù)消色差物鏡,保證FISH熒光成像效果;
3. 進(jìn)口汞燈光源或者高功率多光譜LED光源,滿足所有FISH染料的要求;
4. 操作簡單便捷的FISH圖文系統(tǒng),避免繁瑣的操作,節(jié)省時(shí)間,提高效率;
5. 科研級(jí)像素?zé)晒鈹z像頭,采用新一代大靶面和大像元尺寸sCMOS相機(jī),保證了高靈敏度和分辨率,讓FISH樣本能夠完美還原并保存。同時(shí)相機(jī)可滿足明場(chǎng)樣品的拍攝,可搭配FISH專用圖文系統(tǒng)和專業(yè)顯微成像分析測(cè)量系統(tǒng)。
浩康生物正置熒光顯微鏡可根據(jù)客戶FISH樣本需求定制最佳配置,效果基本達(dá)到進(jìn)口品牌同檔次顯微鏡,但性價(jià)比遠(yuǎn)高于進(jìn)口品牌。另外,浩康生物能夠提供更周到的售后服務(wù),確保在遇到問題時(shí)能夠得到及時(shí)的幫助和解決方案。
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