熒光是一種分子現(xiàn)象，其中一種物質(zhì)吸收特定顏色的光，并幾乎同時輻射出另一種顏色的光。后者的能量更低，波長更長，這個過程被稱為激發(fā)和發(fā)射。許多物質(zhì)都具有熒光特性，包括有機物和無機物。在熒光顯微鏡的早期使用中，顯微鏡學(xué)家觀察的是初級熒光或自體熒光。但是現(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)出許多熒光染料，它們可以發(fā)出非常明亮的熒光，并用于染色樣品的特定部分。這種方法被稱為次級或間接熒光。這些染料被稱為熒光染料，當(dāng)它們與抗體、核酸等其他有機活性物質(zhì)結(jié)合時，也被稱為熒光探針或熒光團?，F(xiàn)在已經(jīng)有許多熒光染料在藍(lán)色、綠色、橙色、紅色和近紅外光譜范圍內(nèi)具有特定的輻射峰值。

01 熒光的分子機理

熒光過程分為三個階段，所有這些事件都發(fā)生在相隔幾個數(shù)量級的時間尺度上。進入光子對敏感分子的激發(fā)發(fā)生在飛秒內(nèi)，而激發(fā)態(tài)電子振動弛豫到最低能級的速度要慢得多，可以在皮秒內(nèi)測量。最后的過程，即發(fā)射較長波長的光子和分子返回基態(tài)，發(fā)生在相對較長的納秒時間內(nèi)。因為激發(fā)態(tài)也可以通過不涉及光發(fā)射的其他非輻射機制來弛豫，與熒光發(fā)射競爭并降低其效率，所以熒光與用于產(chǎn)生激發(fā)態(tài)的光子能量相比，熒光光子的能量較低。

02 熒光染料

熒光染料（或熒光團）是一種熒光化合物，可以在光激發(fā)下重新發(fā)光。熒光染料通常包含多個組合的芳香族基團，或具有多個 π 鍵的平面或環(huán)狀分子。

熒光染料有時單獨使用，作為液體中的示蹤劑、作為某些結(jié)構(gòu)染色的染料、作為酶的底物或作為探針或指示劑（當(dāng)其熒光受到極性或離子等環(huán)境因素的影響時）。它們通常與大分子共價鍵合，用作親和或生物活性試劑（抗體、肽、核酸）的標(biāo)記。熒光染料主要用于在熒光成像中對組織、細(xì)胞或材料進行染色。熒光素通過其胺反應(yīng)性異硫氰酸酯衍生物異硫氰酸熒光素 (FITC) 成為最流行的熒光染料之一。得益于羧基熒光素 (FAM)、TET 等，應(yīng)用已從抗體標(biāo)記擴展到核酸。另外其他常見的熒光染料還有羅丹明 (TRITC)、香豆素和花青的衍生物。新一代熒光染料通常表現(xiàn)更好，比傳統(tǒng)染料更耐光、更亮和/或?qū)?pH 值不敏感。以后有機會我們會專門詳細(xì)來講解熒光染料。

03 熒光光譜

熒光染料的熒光光譜是用熒光光譜儀（熒光分光光度計）測量得到的。

確定特定熒光染料的發(fā)射光譜時，需要確定最大吸收波長（常等同于最大激發(fā)波長）并在該波長下激發(fā)該熒光染料。上圖a中顯示了一個典型熒光染料的吸收光譜，縱坐標(biāo)為吸收的相對強度，橫坐標(biāo)為波長。然后，我們用一個單色器（一種僅允許窄光波段通過的裝置）進行掃描，得到全范圍發(fā)射波長下相對應(yīng)的熒光發(fā)射強度值。上圖b中顯示了基于各波長下熒光相對強度的測量值繪制的發(fā)射光譜。確定特定熒光染料的激發(fā)光譜時，也采用了類似的方法，即在用一組連續(xù)的波長激發(fā)熒光基團的同時，監(jiān)測不同波長下的最大熒光發(fā)射強度。確定最大熒光發(fā)射強度，并只允許最大熒光發(fā)射強度對應(yīng)波長的發(fā)射光通過檢測器。在各激發(fā)波長下（通常通過單色器）誘導(dǎo)激發(fā)，并測量作為波長函數(shù)的發(fā)射熒光強度。測量結(jié)果可繪制為如上圖a所示的圖形或曲線，描繪了全范圍激發(fā)波長光譜相對應(yīng)的熒光強度。

在熒光顯微鏡中，激發(fā)和發(fā)射強度與波長的重疊區(qū)域（如上圖c所示）必須通過選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)濾光片、分光鏡（反射光熒光）和發(fā)射濾光片來消除。否則，激發(fā)光太亮?xí)谏w較弱的熒光發(fā)射光，從而顯著降低標(biāo)本的對比度。

04 熒光信號強度的影響因素

在給定的激發(fā)強度下，熒光染料所發(fā)射的熒光量受多個因素影響，其中包括：

1. 樣品染色部分內(nèi)的染料濃度和樣本的厚度。

2. 染料的消光系數(shù)；消光系數(shù)告訴我們有多少入射光會被給定濃度的染料和給定厚度的樣品所吸收，反映的是波長相關(guān)的吸收特性，由熒光染料的激發(fā)光譜表示。雖然許多熒光染料在峰值激發(fā)波長時有很高的激發(fā)系數(shù)，但實際的試樣制備技術(shù)往往會限制試樣中容許的最大濃度，染色標(biāo)本實際吸收的總光量因而會減少。

3. 染料的量子效率；量子效率指吸收的光能與發(fā)射的熒光之比，它決定吸收的光能中有多少會轉(zhuǎn)化為熒光。常見的最有效熒光染料的量子效率約為0.3，但實際值可能會因為所謂淬滅過程而降低，其中一種是光致漂白。這些因素的結(jié)合，加之許多試樣的受染材料量在觀察視場中非常少，使得典型應(yīng)用中的發(fā)射熒光強度與激發(fā)光強度之比在10-4(極高熒光度樣本)至10-6之間。現(xiàn)行技術(shù) (如熒光原位雜交)使用非常少的熒光材料量，該比值可能低至10-9至10-10。

4. 顯微鏡視場內(nèi)實際存在的受染材料量。

因此，為了能以足夠高的對比度看清熒光圖像，熒光顯微鏡必須能夠在不衰減熒光信號的情況下，將激發(fā)光衰減高達10-11(針對非常微弱的熒光)。

05 熒光顯微鏡中的濾光片

熒光顯微鏡的主要濾光元件是位于熒光濾色塊中的三片濾光片：激發(fā)濾光片、發(fā)射濾光片和二向色分光鏡。

1. 激發(fā)濾光片：只透射照明光中能夠有效激發(fā)特定染料發(fā)出熒光的光，濾色塊一般根據(jù)激發(fā)濾光片的類型命名:

U 用于DAPI和Hoechst 33342等染料的紫外激發(fā)；

B 用于FITC和相關(guān)染料的藍(lán)光激發(fā)；

G 用于TRITC、Texas Red等染料的綠光激發(fā)。

2. 發(fā)射濾光片：衰減激發(fā)濾光片所透射的所有光線并非常有效地透射樣品所發(fā)射的任何熒光。這種光的波長通常大于激發(fā)顏色。它可以是帶通濾光片或長通濾光片。

3. 二向色分光鏡：一片玻璃組件，與顯微鏡的光路成45度角。這種具有反射一種顏色 (激發(fā)光) 而透射另一種顏色 (發(fā)射熒光)的獨特能力。目前的二向色分光鏡具有非常高的效率，激發(fā)光的反射效率高于95%，發(fā)射光的透射效率約為95%。這是一個巨大的進步。二向色分光鏡玻璃(稱為基片)通由低自體熒光材料構(gòu)成，如UV熔融石英。大多數(shù)顯微鏡具有一個滑塊或轉(zhuǎn)臺，可以容納兩個到四個濾光塊或更多。必須注意，各濾光塊中的濾光片是相互匹配的一套組件，應(yīng)當(dāng)避免混用濾光片和分光鏡，除非知道各濾光片組的全部光譜特性。

我們經(jīng)常用U、B和G等顏色激發(fā)光名稱來簡單描述濾光片組，但當(dāng)涉及到用于非常見染料和探針的特殊濾光片組時，這些就不能滿足了，這時一些用于更精確描述濾光片的參數(shù)的信息是必須的。濾光片有帶通和長通之分，人所感知的熒光顏色同時取決于帶寬和特定波長。

以下我們簡單介紹一下熒光濾光片中的一些術(shù)語：

帶通濾光片用中心波長 (CWL) 和帶寬 (FWHM) 表示。中心波長(CWL)為50%峰值透射時波長的算術(shù)波長(納米)平均值。FWHM為50%峰值透射時（全高半寬）的帶寬。長通濾光片(LP) 用50%峰值透射時的開啟或截止波長表示。

濾光片透過率指得對目標(biāo)波段的透光能力，用百分比來表示，透射率越大，代表透光能力越好。最直接的好處就是有效增加熒光圖像絕對亮度，保證樣品被充分探測到。

濾光片衰減水平（也稱為截止深度）一般用光學(xué)密度（OD）單位來表示：OD=-log(Transmission)，指截止范圍內(nèi)的波長所對應(yīng)的透過率，用來描述濾光片截止程度，透光率想要達到0是不可能的，只能讓濾光片的透過率接近于零，才能夠更好的截止不想要的光譜。

熒光染料發(fā)射熒光亮度相比于激發(fā)光亮度的微乎其微，二者共存于測試樣品中，我們要檢測到熒光信號，需要把較強激發(fā)光充分截止到低于熒光亮度的水平。為提高熒光檢測準(zhǔn)確度，通常需要將隔離度提高到OD5以上，才能得到較好的成像效果。對于一些弱熒光成像領(lǐng)域（如熒光原位雜交）則需要OD6甚至以上水平的濾光片。

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