顯微鏡涵蓋許多應(yīng)用，其中包括從生命科學(xué)的基本應(yīng)用到高度發(fā)展成熟的技術(shù)，使用特定的顯微鏡相機就可以檢測和定位數(shù)量極少的光子或單個分子。

在選擇適用于顯微鏡的相機時，既要考慮特定的芯片屬性和相機的有關(guān)方面，也要考慮科學(xué)、醫(yī)療或工業(yè)領(lǐng)域中所需應(yīng)用的需求，您需要在這兩者之間達(dá)到平衡，這一點非常重要。

靶面尺寸和分辨率

顯微鏡相機靶面尺寸往往越大越好，但隨著靶面尺寸的增加往往會導(dǎo)致總成本增加。

顯微鏡相機最終的光學(xué)分辨率取決于光電二極管的數(shù)量和它們相對于顯微鏡光學(xué)透鏡系統(tǒng)投射到成像陣列表面上圖像尺寸的函數(shù)所決定，當(dāng)前可用的CCD陣列隨著尺寸的變化，從幾百至數(shù)千像素。在顯微鏡這一類受限于衍射的光學(xué)儀器中，當(dāng)使用數(shù)值孔徑為1.4的物鏡時，在平均可見光波長（550納米）處的光學(xué)分辨率的阿貝極限為0.2微米。在這種情況下，根據(jù)奈奎斯特采樣定律，當(dāng)像元尺寸大于21μm的一半，即11μm時，相機無法分辨出相距21μm的兩個物體；當(dāng)像元尺寸小于11μm時，可以分辨。盡管CCD成像傳感器中更小的光電二極管可以提高空間分辨率，但同時它們也限制了設(shè)備的動態(tài)范圍。

在用顯微鏡觀察時，圖像通常由光學(xué)系統(tǒng)投影到探測器表面，該探測器可以是人眼的視網(wǎng)膜或者電圖像傳感器。為了優(yōu)化所得到的圖像的信息內(nèi)容，探測器的分辨率必須與顯微鏡的分辨率緊密匹配。

由于芯片在成像系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，因此在選擇芯片時充分考慮特定的性能規(guī)格是非常重要的

黑白或彩色相機

黑白相機由于其量子效率更高，業(yè)界青睞于將它用于熒光應(yīng)用。彩色相機的量子效率低于黑白相機——導(dǎo)致出現(xiàn)這種差異的技術(shù)因素在于彩色相機中每個像素上的拜耳微型濾色片只能讓特定的波長通過。這種過濾機制是為了使用“去拜耳化”的過程來計算圖像的顏色信息。由于濾色片會阻擋一定量的光，因此到達(dá)像素的光子反應(yīng)區(qū)域的光子會有所減少。除了芯片上的拜爾濾色片結(jié)構(gòu)外，彩色相機中的紅外截止濾光片也起到限制光線通過的作用，因為它還可阻擋約650 - 700 nm以上的光線。

通常，我們會使用黑白相機在多張單獨圖像中制作出具有多個熒光標(biāo)記的圖像，以便用于進行特定的檢測以及共定位目標(biāo)分子。通過不同的可選光源和濾光片組，可以為所用的每種熒光基團提供正確的熒光激發(fā)和發(fā)射波長組合。但是，某些應(yīng)用可能會要求僅使用一臺相機在一臺儀器內(nèi)進行彩色成像和熒光處理。如果熒光應(yīng)用對靈敏度的要求不是太高，這個要求是可以實現(xiàn)的。

全局快門和滾動快門

CCD芯片只有全局快門一種快門類型，而CMOS芯片具有兩種類型：全局快門和滾動快門。能否選擇正確的芯片會對成像質(zhì)量帶來重大的影響，在目標(biāo)物體會移動時尤為如此。在滾動快門芯片中，像素是逐行進行曝光的。因此，在接連的兩行像素采集圖像的間隔時間內(nèi)，如果物體改變了位置，那么采集到的兩個像素行就會產(chǎn)生圖像偏斜的現(xiàn)象，造成圖像的空間結(jié)構(gòu)失真。但是，滾動快門芯片有一個技術(shù)優(yōu)勢：由于其像素中的電子部件較少，因此在讀取過程中的噪聲更低。與之不同的是，全局快門芯片會同時對所有像素進行曝光。在這種情況下，不同像素行的曝光之間不存在時間差，因此在物體移動時就不會導(dǎo)致空間結(jié)構(gòu)失真。

靈敏度和動態(tài)范圍

在仔細(xì)研究圖像的成像質(zhì)量之前，非常重要的一點是要先確保系統(tǒng)有足夠的靈敏度來采集熒光信號。根據(jù)不同應(yīng)用的實際情況，熒光信號的強度可能非常弱。我們應(yīng)將靈敏度理解為要生成能與噪聲區(qū)分開來的信號所需要的最小光量。量子效率(QE)是一個重要的數(shù)值，它描述來自光源的入射光子數(shù)量與像素所生成的電子數(shù)量之間的比值。這個比值取決于波長，為了獲得最佳效果，特定芯片的光譜應(yīng)與應(yīng)用中熒光基團的發(fā)光光譜保持一致。量子效率越高，所產(chǎn)生光子的數(shù)量越多，使得曝光時間可以相應(yīng)縮短，那么熒光基團被光漂白的機率就越低，并且還可能提高整體的成像速度。

通常，光源具有一系列廣泛的光線強度也是有益處的，這樣通過一次曝光就能解決問題。滿井容量在這里也是密切相關(guān)的，這個概念描述的是每個像素曝光一次可以產(chǎn)生的最大電子數(shù)。滿井容量越高，在像素飽和之前可以采集到的光線就更多，從而減少了由于像素飽和而要再次進行曝光的情況。

動態(tài)范圍則是將產(chǎn)生真實信號所需的最大電子數(shù)與最低電子數(shù)相結(jié)合，它描述的是相機測量和區(qū)分不同光照等級的整體能力。

成像質(zhì)量和噪聲

噪聲是指真實信號值和測量系統(tǒng)所產(chǎn)生值之間的偏差。在特定的光照等級下，信噪比(SNR)可用于量化成像系統(tǒng)的整體噪聲水平，它是一個用于比較相機的通用參數(shù)。信噪比越高，成像質(zhì)量就越高。在成像過程中，某些噪聲類型幾乎很難通過相機技術(shù)來減少，例如光子噪聲/散粒噪聲，因為它們是由光子本身的物理性質(zhì)而引起的。但是，其他會影響成像質(zhì)量的噪聲類型則會顯著受到芯片本身和相機技術(shù)的影響。近年來，在成像質(zhì)量和性能方面，現(xiàn)代CMOS芯片已經(jīng)超越了以前的CCD技術(shù)。讀取噪聲（或顳暗噪聲）是每次觸發(fā)快門時加到信號中的噪聲，用單位“eˉ/像素”來表示?，F(xiàn)代CMOS芯片的讀取噪聲可低至2eˉ/像素。

當(dāng)曝光時間增加時，另一個與熒光應(yīng)用相關(guān)的噪聲源會變得非常重要，這種噪聲是由暗電流引起的。暗電流是在曝光期間出現(xiàn)的電子泄漏，用單位“eˉ/像素/秒”來表示。一般而言，暗電流會隨著溫度每升高7°C而翻倍

散熱

芯片的溫度對暗電流有至關(guān)重要的影響，會導(dǎo)致信噪比和成像質(zhì)量變差，在光信號較弱且曝光時間較長時尤為如此。這意味著相機散熱很重要，但這在熒光成像中并非絕對必要。由于散熱措施對系統(tǒng)成本有顯著影響，因此大多數(shù)相機并沒有采用主動散熱措施，這對于熒光信號良好的應(yīng)用而言已經(jīng)足夠。但即便如此，這些相機中的設(shè)計也會影響芯片溫度。所以，應(yīng)該通過低功耗的模式來操作相機以避免設(shè)備發(fā)熱。此外，還應(yīng)通過內(nèi)部硬件設(shè)計以及將相機安裝在另一個散熱載體上來有效地將熱量傳輸?shù)酵獠俊?

可以使用熱電元件（珀爾帖效應(yīng)）主動為芯片散熱，通?？山柚娠L(fēng)扇將珀爾帖元件產(chǎn)生的熱量排散到外部。當(dāng)元件的溫度低于環(huán)境溫度時，風(fēng)扇還有助于防止出現(xiàn)冷凝水。如果需要避免在系統(tǒng)中出現(xiàn)振動（可能由風(fēng)扇引起），某些相機還可以支持水冷。

總結(jié)

關(guān)于如何正確選擇顯微鏡相機，這里總結(jié)幾條建議：

1. 第一個關(guān)鍵點是選擇合適的顯微鏡，能夠捕捉你要看的樣品，然后是選擇與之匹配的相機。如果物鏡的光學(xué)分辨率低于你要觀察的結(jié)構(gòu)，那么任何相機都幫不上忙。

2. 我們可以根據(jù)傳感器類型來選擇相機，但不是唯一的辦法。相機列出了許多參數(shù)，最重要的三個參數(shù)是：靈敏度、分辨率和速度，可根據(jù)需求進行選擇。選擇分辨率是需要將相機像元和光學(xué)分辨率進行匹配，在匹配的同時盡量選擇像元較大的相機。如果你需要進行熒光成像，量子效率和讀取噪聲是決定相機靈敏度的兩個關(guān)鍵變量。因此，在選購時需要考慮信噪比（SNR）。

3. 在實際選型中，不同類型的相機對制冷的要求也不盡相同：

①. 對于EMCCD相機，像素尺寸通常較大（常見的為13-16μm），每個像素上產(chǎn)生的暗電流本就較多，而且EMCCD中的暗電流還會和信號一起被增益放大，所以用制冷壓制EMCCD相機的暗電流產(chǎn)生尤其重要。因為這些原因，主流的EMCCD相機制冷溫度都在-50℃以下。

②. 而對于sCMOS相機，不僅像素尺寸會較小一些，也沒有額外的增益，所以對制冷的要求就相對低一點。

4. 在信號較弱的熒光成像中，來自信號的散粒噪聲較??；而暗電流的散粒噪聲（即暗噪聲）在當(dāng)前的高端科研相機都是很低的，在曝光時間1s這個量級甚至更短的時候，暗噪聲通?？梢院雎?；此時讀出噪聲就成為特別需要考量的因素了。對于同樣的芯片，讀出噪聲的大小與讀出速度有關(guān)，無論對于CCD相機還是sCMOS相機，讀出速度越快，讀出噪聲越高。而sCMOS相對于CCD的一個核心優(yōu)勢，就是高速讀出時依然能夠保持極低的讀出噪聲。

案例

近期華中某國家重點實驗室需要一臺倒置熒光顯微鏡，我們工程師了解到客戶主要用于拍攝細(xì)胞，偶爾也會用來拍攝組織染色切片，細(xì)胞具體熒光都是比較常用的染料，熒光也比較亮，不需要長時間曝光，所有倍數(shù)均有拍照需求，我們工程師綜合客戶的需求推薦了浩康生物倒置熒光顯微鏡HIF2000+高分辨率熒光顯微鏡相機HS2000E配置的高性價比方案，HS2000E采用sCMOS芯片，相比CCD具有更低的讀出噪聲和更高的性價比，經(jīng)過試用該配置方案完全滿足客戶需求，并贏得了客戶的認(rèn)可。

熒光顯微鏡相機HS2000E

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