如何高效進行線蟲觀察
線蟲
40多年來,秀麗隱桿線蟲一直被用作神經(jīng)科學(xué)、發(fā)育和分子生物學(xué)以及遺傳學(xué)的模式生物。它是第一個對其整個基因組進行測序的多細(xì)胞生物,并且直到現(xiàn)在,它也是世界上唯一被完整繪制出神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的生物。秀麗隱桿線蟲中的大量基因可以以與哺乳動物相似的方式發(fā)揮作用。秀麗隱桿線蟲基因組中大約 1/3 的基因與某些人類基因同源,因此,該線蟲可用作研究人類相關(guān)疾病的模式生物。線蟲在實驗室中培養(yǎng)非常容易和快速,通常保持在略低于室溫 (15–20 °C) 的溫度。成蟲長約 1 毫米,直徑小于 75 微米。它們保存在瓊脂平板上,即培養(yǎng)皿內(nèi)的瓊脂凝膠,以細(xì)菌(大腸桿菌)為食物。
線蟲的常規(guī)實驗室工作有幾個常見步驟:
1. 挑選線蟲;
2. a) 轉(zhuǎn)基因:將轉(zhuǎn)基因顯微注射到線蟲中以修改其基因組;b) RNA干擾(RNAi):將雙鏈(ds)RNA引入線蟲以抑制基因表達(dá);
3. 篩選:評估線蟲以檢測成功的 RNAi 或轉(zhuǎn)基因;
4. 用各種方法研究線蟲的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué);
5. 線蟲的記錄或功能成像,通常使用共聚焦或復(fù)合顯微鏡完成。
首先,必須選擇和挑選線蟲,然后是基因或蛋白質(zhì)表達(dá)的操作,然后是一段時間的線蟲繁殖。然后根據(jù)表型區(qū)分線蟲,以找到對應(yīng)特征的線蟲。如果這些線蟲太少,可能會重復(fù)前面的步驟。當(dāng)有足夠數(shù)量的具有感興趣特征的線蟲時,它們將被再次挑選、固定,最后進行功能成像。上面顯示的工作步驟不一定按序號順序完成。
一般線蟲培養(yǎng)、挑選、篩選蟲等時需要考慮的幾點:
a. 每個平板中的瓊脂量相同(高度相同)保證更換瓊脂平板時避免重新聚焦;
b. 瓊脂上的細(xì)菌(食物)濃度更低保證獲得更清晰的線蟲顯微鏡圖像
c. 具有薄瓊脂層且無蛋白胨可減少線蟲成像板的熒光背景(自發(fā)熒光)
d. 良好的對比度對透射光可將線蟲與瓊脂區(qū)分開來
e. 良好的熒光信噪比 (S/N) 和暗背景可檢測更微弱的熒光信號以獲得更好的圖像結(jié)果
f. 當(dāng)以更高的總放大倍數(shù)(60 倍以上)對線蟲成像時,確保良好的對比度和高分辨率。
挑選線蟲
在挑選合適的線蟲并準(zhǔn)備它們進行遺傳或生化分析時,通常使用體視顯微鏡選擇線蟲并用小鉑絲或睫毛挑選。然后,為了通過顯微注射在線蟲的性腺中進行基因改造,將它們放置在載玻片上的一個小的干燥瓊脂墊上。
明場中的線蟲篩查
使用多個體視顯微鏡可以實現(xiàn)對線蟲的有效篩選以提高數(shù)量。 配備燈架或小型照明底座的浩康生物HZ6100常規(guī)體視顯微鏡非常適用于線蟲篩查。當(dāng)與輔助物鏡一起使用時,它可以實現(xiàn)更高的放大倍率和分辨率。由于其緊湊的設(shè)計,HZ6100在實驗室中占用的空間也更少。 使用這些顯微鏡可以輕松制作具有高對比度的線蟲圖像,即使在低放大倍率下也是如此。對于教學(xué)人員來說,它們也是特別好的解決方案。
浩康生物 HZ6100體視顯微鏡
下面列出了在使用HZ6100在明場中進行線蟲篩查的不同優(yōu)勢。
★由于有足夠的空間同時容納多個瓊脂平板,因此簡化了標(biāo)本處理,最大限度地減少了平板意外掉落的可能性;
★用于取蟲、顯微注射等操作,有足夠的空間讓用戶的手在物鏡周圍和下方工作;
★學(xué)生課程的干凈設(shè)置,因為沒有外部燈、電纜,也沒有可能從底座上掉下來的設(shè)備;
★由于居中 LED,標(biāo)本成像具有良好的對比度和均勻的照明;
★不使用時易于存放,因為整個顯微鏡裝置很容易放在壁櫥架子上。
浩康生物 HZ7100體視顯微鏡
浩康生物 HZ7100體視顯微鏡也可以實現(xiàn)高效的線蟲篩查。 HZ7100有一個共同的主物鏡 (CMO),因此沒有傾斜的焦平面,雙眼的整個視野都清晰對焦。 此外,該系統(tǒng)是模塊化的,允許您非常快速地靈活添加、交換或更換組件。如果需要多個用戶同時觀察標(biāo)本圖像,并記錄高分辨率圖像以供報告,則可以安裝數(shù)碼相機。例如,具有630萬或更多像素的相機HS600E/HS2000E可以生成高清 (HD) 實時圖像和錄制圖像。
轉(zhuǎn)基因、顯微注射和 RNAi
有一些方法可以改變線蟲的基因/蛋白質(zhì)表達(dá)。通過對線蟲進行顯微注射來進行穩(wěn)定和瞬時的基因修飾。 兩種主要方法是:轉(zhuǎn)座子,也稱為跳躍基因,或CRISPR/Cas9系統(tǒng)。CRISPR 的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)量較低,需要一個世代周期進行選擇,但轉(zhuǎn)基因插入更穩(wěn)定。轉(zhuǎn)座子方法效率更高,產(chǎn)量更高,需要注射的線蟲更少,但轉(zhuǎn)基因整合到基因組中的位置并不總是很清楚。
一旦將線蟲放在載玻片上的干瓊脂墊上,重要的是要快速工作,否則線蟲可能會在操作過程中干燥并死亡。為了減緩線蟲的干燥,通常它會被油覆蓋,例如鹵化碳或石蠟。通常,顯微注射應(yīng)在 5 分鐘內(nèi)完成。將帶有瓊脂墊的載玻片放在倒置顯微鏡的載物臺上,找到一條線蟲,并將轉(zhuǎn)基因 (DNA) 注入遠(yuǎn)端性腺。
浩康生物 HIF2000倒置熒光顯微鏡
然后用恢復(fù)緩沖液覆蓋線蟲,用鉑絲或睫毛挑起并放置在單獨的瓊脂板上進行進一步培養(yǎng)和繁殖。此工作步驟通常在配備微分干涉對比 (DIC) 或集成調(diào)制對比 (IMC) 照明的手動倒置熒光顯微鏡上執(zhí)行,例如 Leica DMi8或浩康生物HIF2000。強烈建議在顯微鏡下設(shè)置抗震裝置以獲得更高的產(chǎn)量。
對于顯微注射針的精確定位,使用高精度3軸油機械手是實用的,例如來自 Narishige Instruments 的機械手
Leica DMi8
RNA 干擾 (RNAi) 用于在翻譯水平上改變蛋白質(zhì)表達(dá)。它是通過用表達(dá)雙鏈 (ds) RNA 的轉(zhuǎn)基因細(xì)菌喂養(yǎng)線蟲來實現(xiàn)的。線蟲攝取 dsRNA,它進入線蟲的所有細(xì)胞(神經(jīng)元除外),經(jīng)過細(xì)胞生化處理,然后產(chǎn)生短干擾 (si) RNA。一旦存在于細(xì)胞中,siRNA 就會改變蛋白質(zhì)表達(dá)。
轉(zhuǎn)基因線蟲育種及熒光篩選
顯微注射后,線蟲進一步培養(yǎng),下一代用于實驗。線蟲保持在 20°C 以進行繁殖。必須避免線蟲干燥,因此瓊脂平板通常存放在塑料盒中。要獲得大量的線蟲,第二種可能是在錐形瓶中進行液體培養(yǎng)。
大約5條線蟲足以進行蛋白質(zhì)印跡分析(識別蛋白質(zhì))。然而,差分梯度離心需要 10萬條線蟲才能按密度分離細(xì)胞器和蛋白質(zhì)。
由于轉(zhuǎn)基因通常與綠色熒光蛋白 (GFP)結(jié)合,因此可以使用熒光體視顯微鏡對其進行選擇。其他熒光標(biāo)記如 DsRed在高表達(dá)水平下可能有毒,因此通常選擇 GFP 標(biāo)記。
使用明場定位線蟲,檢查熒光信號,然后挑選進行其他實驗。對于成像,通常首選較年輕的線蟲,因為較老的線蟲通常表現(xiàn)出更高的自發(fā)熒光,尤其是在腸道中。將選定的線蟲放在特殊的小瓊脂板上,不含蛋白胨和細(xì)菌,以最大限度地減少自發(fā)熒光。瓊脂層通常非常薄以進一步減少自發(fā)熒光。使用浩康生物HZF7000/HZFX800體視熒光顯微鏡,可以對線蟲進行高效熒光篩查。
浩康生物HZF7000體視熒光顯微鏡
熒光篩查的重要考慮因素
★為了獲得最高的對比度和分辨率,選擇合適的底座;
★選擇很少產(chǎn)生或沒有熒光成像的背景光“噪音”的底座;
★使用帶有雙面鏡凹面的底座時,在高倍率下可獲得更好的對比度和更高分辨率的圖像。
★使用帶有外部光源的底座時,避免在不需要時加熱線蟲。
★對于高自發(fā)熒光的情況,降低熒光激發(fā)強度會增加信噪比。在許多情況下,來自線蟲的熒光信號是最大的,并且不能增加更多,但背景總是可以。
功能成像
正置共聚焦和熒光顯微鏡,例如HF3000正置熒光顯微鏡,通常用于線蟲的成像和記錄以獲得亞細(xì)胞的高分辨率圖像和大分子結(jié)構(gòu)。
浩康生物HF3000正置熒光顯微鏡
對于共聚焦成像,線蟲表達(dá)熒光蛋白,即 GFP、紅色熒光蛋白(RFP、mCherry 或 DsRed)、黃色熒光蛋白(YFP)或青色熒光蛋白(CFP)。
神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)熒光蛋白CFP、GFP、YFP和DsRed
線蟲位于板中瓊脂層的頂部需要正置共聚焦和熒光顯微鏡。線蟲移動相對較快,所以它們通常被藥物L(fēng)evamisol麻醉,然后將蓋玻片放在它們上面,以便通過液浸物鏡進行觀察。幼蟲階段的幼蟲對光非常敏感,因此使用共聚焦共振掃描儀,由于停留時間短,可以將光毒性問題降至最低。共振掃描儀允許對線蟲幼蟲進行長期觀察,而不會造成明顯的損壞
總結(jié)
線蟲的常用方法涉及使用體視顯微鏡和熒光顯微鏡等多個工作步驟。線蟲實驗室的需求可能會有所不同,可以使用多種儀器配置來解決工作步驟中的特定任務(wù)
以下是常用顯微鏡解決方案的列表:
一、線蟲挑選通常使用普通體視顯微鏡(如浩康生物HZ6100)進行,使用產(chǎn)生高對比度的透射光底座;
二、轉(zhuǎn)基因顯微注射是通過倒置熒光顯微鏡(如浩康生物HF3000)實現(xiàn)的,使用顯微操縱器定位針頭和 DNA 注射器;
三、熒光篩選可以使用體視熒光顯微鏡(如浩康生物HZF7100 或 HZFX800);
四、使用透射光底座實現(xiàn)非常好的對比度;
五、明場篩選通常使用普通主物鏡 (CMO) 體視顯微鏡進行(如浩康生物 HZ7100);
六、功能成像,即用于細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、衰老、神經(jīng)元活動等研究的轉(zhuǎn)基因線蟲的表征,是通過正置熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡完成的;
七、固定的線蟲也可以使用更高性能的熒光體視顯微鏡(如浩康生物
HZF7100)和透射光底座;為了對線蟲胚胎進行成像,建議使用共焦共振掃描儀以實現(xiàn)低光毒性;對于教室、教學(xué)實驗室和培訓(xùn),顯微鏡設(shè)置要求可能與研究實驗室不同。
廣州浩康生物科技有限公司