什么是相差顯微鏡
一、什么是相差顯微鏡
相差顯微鏡是常見的一種顯微鏡,在很多實(shí)驗(yàn)室中都可以見到,利用光線穿過透明樣品時(shí)產(chǎn)生的相位差轉(zhuǎn)換為圖像中的振幅或?qū)Ρ榷炔畹脑?,主要是用來觀察細(xì)菌,細(xì)胞等細(xì)胞結(jié)構(gòu)的透明樣品。因?yàn)樗梢栽谧匀粻顟B(tài)下檢查活細(xì)胞,而無需事先對(duì)細(xì)胞殺死、固定和染色的優(yōu)點(diǎn),相差顯微鏡可以高清晰度和高對(duì)比度地觀察和記錄動(dòng)態(tài)的生物過程,可以用來進(jìn)行細(xì)胞周期等方向的研究。
相差顯微鏡的出現(xiàn)得益于相襯顯微技術(shù)的發(fā)明,相襯顯微技術(shù)是顯微技術(shù)的中的一個(gè)重大進(jìn)步,它的發(fā)明人澤尼克也因此獲得了1953年的諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。
二、相差顯微鏡的原理
相差顯微鏡的核心是一個(gè)位于聚光鏡孔徑光闌位置的相差環(huán)板和位于物鏡后方的相位板。首先光線從照明用的燈絲內(nèi)的一點(diǎn)射出,由場(chǎng)透鏡精確的聚焦在聚光鏡處的相差環(huán)板的開放處。由于這個(gè)位置處在聚光鏡的前焦平面,光線在通過聚光鏡后將變成平行光。假設(shè)這兩束光線在標(biāo)本處不發(fā)生衍射,它們將平行的射入物鏡,所有的平行光都會(huì)聚焦在物鏡后方的相位板上。但實(shí)際上,部分光線通過標(biāo)本以后部分光線將會(huì)發(fā)生衍射,為了完成調(diào)整相位的需求,需要調(diào)整物鏡后方的相位板即可。相位板的另一個(gè)作用是將未被標(biāo)本影響的光線減弱,用對(duì)中望遠(yuǎn)鏡觀察物鏡后方的相位板,可見減光材料形成的暗環(huán)。
物鏡后方的相位板由共軛面和補(bǔ)償面組成,共軛面為環(huán)狀,是直射光通過部分,通常涂有吸收光線的物質(zhì),補(bǔ)償面位于共軛面的內(nèi)外兩側(cè)部分,是通過衍射光的部分。
光線通過相差環(huán)板射入,通過聚光鏡射出后形成平行的波陣面。當(dāng)這些平面波碰到樣本的時(shí)候,一些光在穿過標(biāo)本時(shí)發(fā)生衍射,改變了它們和直射光之間的相位關(guān)系,新產(chǎn)生的球面波在從標(biāo)本射出后相位將被延遲λ/4。注意到現(xiàn)在有兩種類型的波,直射光和衍射光,它們之間存在λ/4的相差。在正相襯中,共軛面只鍍有吸收膜,補(bǔ)償面則鍍有相位膜,這樣直射光A僅被吸收,振幅減少,相位未被推遲;而衍射光B的相位則被延遲λ/4,使其與直射光的相位相差λ/2(λ/4+λ/4),在中間相平面上的合成波C的振幅等于兩波振幅的差(引起相消干涉),這時(shí)樣本要比背景暗(因?yàn)楸尘爸挥兄鄙涔?,被吸收,振幅減少),這就是正相襯的效果。
相反在負(fù)相襯中,由于相位板的共軛面不僅鍍有吸收膜,而且還鍍有相位膜,除了吸收直射光使其振幅減小外,而且也把直射光的相位延遲λ/4,這樣使直射光A與衍射光B維持同一相位,則合成波C等于直射波與衍射波振幅的和(引起相長(zhǎng)干涉),因背景只有直射光的照明,而樣本則比背景明亮。
這樣就通過相差顯微鏡改變直射光或衍射光的相位,把人眼無法鑒別的相位差變成了眼睛能測(cè)量到達(dá)視網(wǎng)膜的光線能量強(qiáng)度振幅差(明暗差),在觀察細(xì)胞的時(shí)候也就不會(huì)對(duì)細(xì)胞標(biāo)本產(chǎn)生傷害。
三、相差顯微鏡的優(yōu)勢(shì)
相差顯微鏡可以觀察未經(jīng)染色的活細(xì)胞等樣品,相對(duì)于其它對(duì)比增強(qiáng)技術(shù),如DIC,相差顯微鏡不使用偏振光照明,因而可以觀察雙折射介質(zhì),如透過塑料培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿進(jìn)行活細(xì)胞觀察,可以清楚觀察到樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)(如細(xì)胞核),這在細(xì)胞學(xué)研究上特別有用。如和落射熒光技術(shù)連用,相差物鏡可以透過約70%的激發(fā)光,優(yōu)于DIC,所以相差往往作為輔助成像功能應(yīng)用在熒光顯微鏡上。此外,相差套件的采購(gòu)價(jià)位相對(duì)較低,使用調(diào)校也較為簡(jiǎn)單。
但是相襯顯微技術(shù)存在一些固有的不足。由于必須使用環(huán)形光闌,啟用相襯照明時(shí)聚光鏡的數(shù)值孔徑有所限制,所以相襯成像的軸向分辨率較低。另外,標(biāo)本和背景折射率差異較大的分界處會(huì)出現(xiàn)明顯的光暈,導(dǎo)致如細(xì)胞膜、細(xì)胞器外緣等位置的細(xì)節(jié)被遮蔽。
四、相差顯微鏡的應(yīng)用
相差顯微鏡主要用于對(duì)透明標(biāo)本的高對(duì)比度成像,如活細(xì)胞(通常在培養(yǎng)基中)、薄組織切片、光刻圖案、纖維、乳膠分散體、玻璃碎片和亞細(xì)胞顆粒(包括細(xì)胞核和其他細(xì)胞器)。
另外相差顯微鏡廣泛應(yīng)用于臨床中,新鮮液體標(biāo)本中細(xì)胞和微生物的檢查,尤其適用于活細(xì)胞檢查。一般是取新鮮液體標(biāo)本,加上蓋玻片(如用油鏡時(shí),還需在蓋玻片上滴加鏡油)立即進(jìn)行檢驗(yàn)。如:血液學(xué)檢驗(yàn)中用于血小板計(jì)數(shù)、血液中寄生蟲檢查和某些活細(xì)胞觀察等;微生物學(xué)檢驗(yàn)中用于不染色或染不上色的細(xì)菌、螺旋體、真菌孢子等的快速辨認(rèn),特別是對(duì)具有鞭毛、莢膜等特殊形態(tài)微生物的鑒別,還有尿分析中用于辨認(rèn)新鮮尿中各種細(xì)胞和管型,特別是透明管型、白細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞以及紅細(xì)胞形態(tài)的分類等。
五、相差顯微鏡的使用方法
1.打開顯微鏡明場(chǎng)電源開關(guān)(“︱”為開,“O”為關(guān))
2.將樣品置于載物臺(tái)上
3.將顯微鏡光路調(diào)至目鏡觀察位置
4.從低倍鏡開始觀察,調(diào)節(jié)到與鏡頭相匹配的相差環(huán),熒光濾塊調(diào)到空檔的位置
5.調(diào)節(jié)透射光光強(qiáng),調(diào)節(jié)焦距,找到預(yù)觀察視野
6.依次換到高倍鏡,(注意調(diào)節(jié)相差環(huán))觀察樣品
7.拍照時(shí)將光路選擇調(diào)至相機(jī)拍攝位置
注意:
1. 光源亮度和孔徑光闌應(yīng)適當(dāng)調(diào)大,因?yàn)橄嗖瞽h(huán)板和相位板遮掉大部分光源;
2. 樣品不能太厚,以5-10um左右為宜,否則將影響成像質(zhì)量;
3. 選取高品質(zhì)載玻片和蓋玻片,厚度等應(yīng)符合標(biāo)準(zhǔn);
4. 安裝時(shí)應(yīng)把每個(gè)相差環(huán)調(diào)節(jié)到最佳狀態(tài)。
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